Üretim tezgahları, masaların yüzeyleri, araç-gereç ve cihaz yüzeylerinden alınan swab örnekleri ile bu yüzeylerdeki patojen (Salmonella spp., L.monocytogene, S.aureus) ve indikatör (E.coli, Koliform Bakteriler, Toplam Bakteri ve Maya-Küf) mikroorganizmaların tespiti yapılmalıdır. İşletme içi risk oranına göre kritik noktalar ve ekipmanlar seçildikten sonra uygun yöntem belirlenir. Ekipman hijyen kontrolü, yerinde ölçümler ile organik kirliliğin saptanması şeklinde ya da analiz amaçlı doğru teknik ve swab ile numune alımı şeklinde gerçekleştirilir.
S. aureus :
Gıda maddeleri üzerinde uygun koşulları buldukları anda çoğalmaya başlayan ve toksin üreten ve bu toksinlerin gıda maddeleri ile vücuda girerek zehirlenmelere neden oldukları kesin olarak saptanan iki bakteri çeşidi bulunmaktadır.
Bunlardan bir clostridium botulinum bakterisi, diğer ise staphylococcus aureus bakterisidir. Staphylococcus aureus, insanlarda menenjit hastalığına, iltihaplı yaralara ve eklem romatizmalarına yol açmaktadır. Bir kısmı ise bağırsak rahatsızlıklarına yol açmaktadır. İnsanlarda hastalığa neden olan ve yüksek derecede ısıl stabilitesi gösteren protein yapısında 5 ton toksin üretmektedir. Koagülaz ve termostabil nukleaz enzimi üreten S. aureus ’un suşları genellikle gıdalarda gelişerek ısıl işleme dayanıklı enterotoksin ürettiğinden dolayı gıda zehirlenmelerine neden olmaktadır. S. aureus suşları yaklaşık olarak %30 enterotoksin üretmektedir. Spor oluşturmadığı halde vücut dışında canlılığını uzun süre koruyabiliyor olmasından dolayı tek insan patojenidir. Gıda maddelerinde ve gıda işletmelerinde staphylococcus aureus bakterilerine rastlanması, hijyen eksikliğinin en büyük göstergesidir.
Staphylococcus bakteri türleri içinde, insanlarda en fazla hastalık oluşturan tür olan staphylococcus aureus bakterilerin tespit etmek için koagülaz üretimi yöntemi uygulanmaktadır. Mikrobiyoloji laboratuvarlarında en fazla uygulanan koagülaz testi, lam testidir. Bu testler ile hızlı sonuç alınmaktadır ancak bu faktör staphylococcus aureus’ un bazı kökenlerinde olmadığı için lam testi ile negatif sonuçlar da alınmaktadır. Bazı durumlarda da kümelenme faktörü yüzünden doğru sonuç alınmamaktadır. Bu nedenle lam testinde negatif sonuç alınıyorsa, doğrulama için tüp testine başvurulması gerekmektedir. Her şeye rağmen laboratuvarlar açısından basit olduğundan, staphylococcus aureus tespit edilmesinde koagülaz testleri hızlı ve yüksek doğruluk sağladığı için kullanılmaktadır.
Gelişmiş laboratuvarlarda, mikrobiyolojik analizler arasında hızlı test yöntemleri ile staphylococcus aureus sayımı (koagülaz pozitif staphylococ) çalışmaları yapılmaktadır.
Bu çalışmalarda, ulusal ve uluslararası kuruluşlar tarafından yayınlanan standartlar esas alınmaktadır. Bu standartlardan birkaçı şunlardır:
*TS 6582-1 EN ISO 6888-1 Gıda ve hayvan yemlerinin mikrobiyolojisi – Koagulaz – Pozitif stafilokokların (staphylococcus aureus ve diğer türler) sayımı için yatay metot – Bölüm 1: Baird-Parker agar besiyeri kullanarak
*TS 6582-2 EN ISO 6888-2 … Bölüm 2: Tavşan fibrinojeni agar besiyeri kullanarak
*TS 6582-3 EN ISO 6888-3 … Bölüm 3: Belirleme ve düşük sayımlar için ems tekniği
E.coli :
Escherichia coli bakterisi genel olarak e. coli kısaltması ile tanınan bir koli basilidir. Eşerihiya koli olarak okunan e. coli bakterisi, daha çok memeli hayvanların kalın bağırsaklarında yaşayan bir bakteri türüdür. Escherichia coli, memeli hayvanların kalın bağırsağında yaşayan bakteri türlerinden biridir.Gıda alanında işleme, depolama ve taşıma araçlarında mikrobiyolojik bulaşma riski yüksektir. Gıdalarda, asla bulunmaması gereken mikroorganizmalardan biride koliform bakterilerdir ve en zararlı olarak bilineni ise Escherchia coli’ dir. Vücut ısında hızlı bir şekilde çoğalmaktadır. E. Coli önemli bir hijyen kriteri kabul edilmektedir.Gıda işletmelerinde yüzey, personel ve kullanım sularında kontrol edilir. Bu yüzden de çevresel sularda e. coli bakterisinin varlığı, dışkı kirlenmesinin bir belirtisi olmaktadır. E. coli bakterisi, esas olarak bakteri biyolojisi alanında üzerinde çok fazla çalışılan bir organizmadır. Hatta mikroorganizmalar içinde hakkında en fazla şey bilinen bakteri türünün escherichia coli bakterisi olduğunu söylemek yanlış olmaz.
Yetişkin bir insanın dışkı yolu ile bir günde vücudundan atılan e. coli bakteri sayısı 100 milyar ila 10 trilyon arasında değişmektedir. Dışkıyı oluşturan bakteri türü aerobik bakterilerdir. Hayvanlarda herhangi bir etkisi olmayan e. coli bakteri türleri insanlara bulaştıkları zaman hastalıklara neden olmaktadır. Bunların en bilineni ise O157:H7 isimli türüdür ve kanlı ishale neden olmakta, hatta ölümlere yol açmaktadır. Vücut sıcaklığından kolayca çoğalabilirler. E. coli O157:H7 türü bakteriler yeryüzünde gıda kaynaklı en tehlikeli patojenlerdir. Hiçbir gıda ürününde, 25 gram test örneğinde e. coli O157:H7 bakterisinin bulunmasına izin verilmemektedir.
Escherichia coli bakterisi testlerinde özel kitler kullanılarak hızlı testler yapılmaktadır. Bunlardan biri e. coli O157 bakterisinin hızlı analizi için kullanılan ve immun akış prensibi ile hazırlanmış immunolojik test kitleridir Bu kitler sayesinde ön zenginleştirme aşamasından sonra genelde 30-40 dakika içinde test sonucu alınmaktadır.
Gelişmiş laboratuvarlarda, mikrobiyolojik analizler çerçevesinde, hızlı test yöntemleri ile E. coli sayısı tayinine yönelik analizler yapılmaktadır. Bu analizler sırasında yerli ve yabancı standartlar ve analiz yöntemleri esas alınmaktadır. Bu konuda dikkate alınan standart ise şudur:
*TS EN ISO 16654 Gıda ve hayvan yemlerinin mikrobiyolojisi – Eschericha coli O157’nin tespiti için yatay yöntem.
Koliform Bakteriler
Mikrobiyolojik su analizleri, belli mikroorganizmaların tanımlanması için yapılan çok çeşitli analizler içermektedir. Bunlar arasında escherichia coli, fekal koliform, toplam koliform, sülfit indirgeyen clostridiumlar, fekal streptokoklar, heterotrofik canlı sayımları ve pseudomonas aureginosa gibi analizler bulunmaktadır. Bu mikroorganizmalar içinde sularda en fazla bakılanlar, escherichia coli, toplam koliform ve fekal koliformlardır.
Gram negatif, fakültatif anaerob, spor oluşturmayan çubuk şeklinde ve laktozdan 48 saat içinde gaz oluşturan bakteriler koliform bakteriler olarak tanımlanmaktadır. Koliform bakterisi, toprak, bitki ve sıcakkanlı hayvanların mide bağırsak kanallarında bulunur. Gıda mikrobiyolojisinden en önemli grup koliform grup bakterilerdir. Hijyenik koşullara pek çok uyulmaması sebebi ile gıdalarda bulunabilmektedir. Koliform grup mikroorganizmalara pek çok gıda hammaddesinde rastlanmaktadır. Bunların başında ise, taze sebzeler, taze yumurta, çiğ süt, kanatlı etleri ve koliform bakımından sayıca zengin sulardan alınan kabuklu ve diğer su ürünleri gelmektedir. Koliform bakteriler, toplam koliform veya Fekal koliform üzere karakteristik özelliklerine göre ayrılmaktadırlar. Gıdalarda koliform mikroorganizmasının bulunması kötü sanitasyon koşullarının, yetersiz veya yanlış pastörizasyon uygulamalarının, pişirme ve pastörizasyon sonrası tekrar bulaşma olduğu kabul edilmektedir.
Bakteriyolojik su analizler için alınacak örneklerin miktarı, suyun ne kadar kirli olduğuna bağlıdır. Suların toplam koliform analiz sonucu pozitif çıkıyorsa, başka özel bazı bakteriler açısından da suyun analiz edilmesi gerekmektedir.
Bu bakteriler, koliform grubuna giren fekal koliformlar ve escherichia coli bakterileridir. Fekal koliformlar, hayvanların ve insanların bağırsak sistemleri özgü bakterilerdir. Bunların tespit edilebilmesi için daha farklı analizlere gerek bulunmaktadır. Sularda tek başına escherichia coli bakterisini tespit etmek, toplam koliform bakterilerini tespit etmekten daha önemlidir, çünkü escherichia coli bakterisi sulara hayvan veya insan dışkısının bulaşmış olduğunu göstermektedir.
Escherichia coli bakterisinin yüzlerce farklı çeşidi bulunmaktadır ancak bunların birçoğu insan sağlığı açısından zararlı değildir. Sadece yaşlılarda, çocuklarda ve bağışıklık sistemi sorunlu olan kişilerde ciddi rahatsızlıklara yol açabilir. Mikrobiyolojik su analizlerinde escherichia coli ve toplam koliform bakterilerinin aranması ve sayılmasında kullanılan bütün standart yöntemler koliform grubu bakteri aranmasına yöneliktir. Bu yöntemler arasında en muhtemel sayı (EMS) yöntemi, katı besiyeri yöntemleri ve membran filtrasyon yöntemi yanında hızlı analiz yöntemi de bulunmaktadır.
Hızlı analiz yöntemi renk değişimini esas alan bir yöntemdir. Test tüplerinde renk değişiklikleri gözlenerek sonuç alınmaktadır. Bu yöntem hızlı ve basit yoldan, sularda escherichia coli bakterilerinin varlığı veya yokluğu hakkında bilgi vermektedir. Bu yöntemde sonuç pozitif ise, 100 ml su örneğinde en az 1 tane escherichia coli var demektir. Ancak bu yöntem ile bulaşmanın sebebi anlaşılmaz ve soruna bir çözüm geliştirilemez.
Yetkili laboratuvarlarda, mikrobiyolojik analizler kapsamında, hızlı test yöntemleri ile koliform bakteri tayinine yönelik çalışmalar yapılmaktadır.
Toplam Aerobik Koloni
Tüm gıda maddeleri hasattan tüketiciye ulaşana kadar geçen tüm aşamalarda mikroorganizmalarla kontamine olurlar. Gıdalarda bulunan mikroorganizma yükü, limitleri aşarsa halk sağlığı tehlikeye girer. Bu nedenle gıdalarda mikroorganizma yükü özellikle gıda güvenliği açısından kontrol edilmesi gereken bir parametredir. Toplam aerobik mikroorganizma sayımı, kalite parametrelerinden biri olarak kabul edilmektedir. Toplam aerobik mikroorganizma sayımı ile gıdanın üretim, depolama ve taşıma gibi aşamalarının koşulları, katkı maddelerinin kullanımı ve raf ömrü hakkında bilgi sahibi olunabilir. Toplam bakteri (jerm) sayımı -genel olarak- hijyen kontrolü amacıyla yapılır.
Toplam bakteri ile “toplammezofil aerob bakteri” kastedilir. Toplam psikrofiller, toplam termofiller ve diğer gruplarda da (anaerob) sayım aynı esas ile yapılır. Kimi kaynaklarda APS (Aaerobic Plate Count) ve AKS (Aerobik Koloni Sayısı) olarak ifade edilen budur. Analiz edilen örnekte PCA besiyerinde gelişebilen mayalar varsa bunlar dasayıma dâhil edilir. Aerobik bakteri sayımlarında genel olarak; psikrofilik, mezofilik, termofilik gruplarında ve aerobik / anaerobik koşullardaki bakteri sayıları belirlenir. En yaygın olarak yapılan mikrobiyolojik analiz de ‘Toplam Mezofilik Aerobik Koloni Sayımı’ dır. Aerobik bakteri sayımı gibi analizler ile tüketilen gıdaların kalitesi hakkında fikir sahibi olabiliriz. Bu nedenle, üretilen gıdanın tüketime kadar geçtiği tüm aşamalar hakkında bilgi sahibi olabilmek için aerobik koloni sayımı gibi analiz işlemleri yapılmaktadır.
Küfler genel olarak 24-48 saat inkübasyonda gelişerek koloni oluşturamazlar. Çoğu kez Plate Count Agar olmak üzere, genel bir besiyerinde standart yayma ya da dökme yöntemiyle ekim ve inkübasyondan sonra bu besiyerinde oluşan koloniler sayılarak bakteri sayısı belirlenir. Plate Count Agar besiyeri, ISO 4833 ve FDA Form 2400a 3/01 ve daha pek çok uluslararası standarda uygun olarak toplam bakteri analizinde kullanılmaktadır. Not 01: Günlük ve standart uygulamada inkübasyon sıcaklığı 28 o C ve süresi 48 saattir. Bu şekilde genel hijyen ya da işletme sanitasyonu kontrol edilir. Avrupa ülkelerinde yaygın olarak 30-32 oC kullanılır. İnkübasyon sıcaklığı ABD’nde 35-37 o C ve inkübasyon süresi 24-48 saat olarak benimsenmektedir ve bu şekilde gıdanın potansiyel tehlikesi belirlenir. Bu nedenle inkübasyon parametreleri rapora yazılmalıdır.
Benzer uygulama koliform grup bakteri analizinde de vardır. Not 02: Süt ürünlerinde toplam bakteri analizinde Plate Count Skim Milk Agar besiyeri kullanılması IDF (Uluslararası Sütçülük Federasyonu; International Dairy Federation) tarafından önerilmektedir.
Kullanılan Malzeme
Maximum Recovery Diluent (Merck 1.12535)
¼ Ringer Çözeltisi (Merck 1.15525)
Plate Count Agar (Merck 1.05463)
Plate Count Skim Milk Agar (Merck 1.15338)
Su Agar (bileşimi; %1 Agar-agar olan damıtık su)
Küf ve Maya
Bazı maya ve küf türleri gıda sanayiinde faydalı mikroorganizmalar olarak kullanılırlarken, pek çok tür ise fermentasyon ve gıda sanayinde istenmeyen kontaminantlardır ve bu türler genellikle saprofit özellikte olup gıdanın bozulmasına ve üretimin istenilen şekilde sonuçlanmamasına sebep olabilirler. Maya ve küfler, oldukça geniş pH aralığında (pH 2-9), depolama sıcaklığında (10-35 oC) ve su aktivitesinde (0,85 ve üzeri) üreyebilmektedirler. Yüksek tuz ve şeker konsantrasyonuna sahip ortamlarda kolaylıkla gelişebilmekle birlikte, kompleks karbonhidratları, organik asitleri, proteinleri ve lipitleri de kullanabilmektedirler. Bozulmaya yol açan maya ve küfler gıdalarda acı tat ve kötü koku oluşumu, gaz oluşturma özellikleri sayesinde, bazı gıdalarda istenmeyen gözenekli yapı oluşumu gibi bir takım bozukluklara neden olabilmektedirler. Bazı küf türleri ise bulaştıkları gıda maddesinde gelişerek salgıladıkları toksik metabolitler, mikotoksinler nedeniyle, gıda maddesinin tüketilmesi durumunda ölümle sonuçlanabilen zehirlenmelere yol açabilmektedirler. Bazı maya küflerin ise enfeksiyona neden olabilir.
Gıdalarda maya ve küf analizi, gıda örneğinde mevcut diğer bakterilerin gelişiminin önlenerek küf ve mayaları izole edip, sayımı ilkesine dayanır. Maya ve küf sayımı için kullanılan besiyerlerinde bakterilerin gelişerek koloni oluşturmaları, yüksek asitlik veya çeşitli antibiyotikler kullanılarak engellenir. Çoğu standartta toplam küf ve maya sayısı dikkate alınırken, maya ve küf sayılarının ayrı ayrı ele alınması da mümkündür. Bu durumda besiyerlerinde bu iki mikroorganizmaların morfolojileri göz önünde bulundurularak ayrı ayrı sayımları yapılır veya amaca uygun olarak farklı özelliklerde besiyerleri kullanılabilir. Örneğin, sadece mayaların gelişmesi isteniyorsa besiyeri bileşimine %0,25 oranında sodyum propiyonat katılarak küf gelişimi baskılanabilir. Aseptik koşullarda alınarak laboratuara getirilen gıda maddesi 1:10 oranında homojenize edilir ve aynı şekilde ileri seyreltimleri yapılır.(10², 10³,…) Yani 25 g örnek 225 ml diusyon sıvısı içine veya 10 g örnek 90 ml. dilusyon sıvısı içine tartılır ve stomacher de karıştırılır. Dilusyon serileri içinse 1:10 luk seyreltimden başlayarak 10 ml. alınır ve ayrı bir 90 ml. dilusyon sıvısı içine ilave edilir ve vortex blender’da karıştırılır.
Her seyreltimden daha önce hazırlanmış selektif agar plaklarına 0,1 ml yayma plak tekniği ile ekim yapılır. Petriler 25-28 C’ de 3-5 gün süreyle inkübe edilir.
3., 4. ve 5. günlerde incelenir. 5. Gün sonunda tam sayım yapılır ve sonuç kob/ml (gr) olarak kaydedilir.
Küflerin mayalara göre geç koloni oluşturmaları ve kolonilerin, daha önceden oluşmuş maya kolonilerinin üzerini örtme ve sayımını zorlaştırmaları olasılığına karşılık, mayaların daha erken sayılması veya petri üzerinde işaretlenmesi (4-3.Gün) ve 5. Günün sonunda tam sayımın yapılması yararlı bir uygulamadır. Sayımda petri yüzeyindeki uygun sayım aralığındaki (10 – 100) üremeler sayılıp seyreltim faktörü ile çarpılarak küf-maya sayımı ayrı ayrı veya toplam olarak kaydedilir. Küf ve maya analizlerinde dökme plak yöntemi ve yayma plak yöntemi kullanılabilmekle beraber, besiyeri yüzeyinde maya ve küflerin daha hızlı üremesi, düzgün ve standart koloni oluşumu, sayım sonrası izolasyon ve identifikasyon kolaylığı nedeni ile yayma plak yöntemi daha çok tercih edilmektedir. APHA ve IDF yönergelerine uygundur. In vitro (canlı hücre dışında) yapılan standart mikrobiyolojik analizlerde maya ve küflerin geliştirilmesi ve sayılması için selektif katı besiyeri olarak kullanılır. Hazırlanmış besiyeri pembe renklidir ve 25 oC’da pH’sı 5,6±0,2’dir.
Küfler; “miselyum oluşturan çok hücreli funguslar”, mayalar ise “tek hücreli ve genellikle miselyum oluşturmayan yapılar” olarak tanımlanır. Maya ve küf tayini, gıda üzerindeki bakterilerin gelişimleri önlenir ve maya – küf izole edilerek sayılması esasına dayanır. Maya ve küfler gıdada, yapı bozukluklarına, gaz oluşumuna, acı tat ve kötü kokuya neden olabildiği gibi salgıladıkları toksik madde nedeniyle gıda zehirlenmelerine de neden olurlar. Maya ve küf özellikle açıkta pazarlanan, paketleme öncesi açık havaya maruz kalan, ambalaj materyalinden bulaşma olabilen, yıkama ve soğutma/dondurma dışında herhangi bir ısıl işlem görmeyen ürünler için bir kalite kriteridir. Gıda ürünlerinde, küf ve maya aranmakta ve alınan sonuca göre üretim, işletme hijyeni, personel hijyeni ve çalışma ortamı hakkında fikir sahibi olabilmekteyiz. Gıdalarda “Maya ve Küf Sayımı” için bize ulaşabilirsiniz.
